Diseño, fabricación, caracterización y validación de una plataforma integrada y modular para la amplificación de secuencias específicas de ADN por PCR basada en dispositivos de microfluídica digital
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las técnicas de biología molecular más conocidas en el ámbito del diagnóstico de patologías y detección de organismos en diferentes tipos de muestras. Esta técnica permite crear múltiples copias de una secuencia específica de ADN, realizando...
| Main Authors: | , , |
|---|---|
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| Language: | spa |
| Published: |
Servicio de Publicaciones. Universidad de Navarra
2023
|
| Subjects: | |
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| author | Zabalo-Carrere, J. (Jon) Arana-Alonso, S. (Sergio) Lorenzo, E. |
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| description | La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las técnicas de biología molecular más
conocidas en el ámbito del diagnóstico de patologías y detección de organismos en diferentes
tipos de muestras. Esta técnica permite crear múltiples copias de una secuencia específica de
ADN, realizando varios ciclos compuestos por etapas a diferentes temperaturas. De esta forma,
partiendo de una cantidad reducida de muestra a analizar, se crean suficientes réplicas del
fragmento de ADN de interés como para que sea analizable o detectable en detalle. Entre las
aplicaciones principales de la PCR destacan la detección de enfermedades infecciosas como el
VIH o el SARS-CoV-2 y la detección de mutaciones en el ADN que puedan provocar
enfermedades como el cáncer, además de la detección de patógenos o trazas de alérgenos en
diferentes alimentos.
Las reacciones de PCR se suelen llevar a cabo en equipos de laboratorio conocidos como
termocicladores, los cuales están compuestos de un elemento calefactor que se encarga de ciclar
térmicamente las muestras a analizar. Sin embargo, estos instrumentos requieren rampas de
temperatura y volúmenes de muestra relativamente grandes para realizar las reacciones. Ante
este problema, la irrupción de la tecnología lab-on-a-chip y la microfluídica han acelerado el
desarrollo de sistemas miniaturizados para llevar a cabo diversos análisis de biología molecular
de forma más eficiente.
En concreto, la microfluídica digital (DMF) ofrece las ventajas propias de los sistemas
microfluídicos convencionales como tiempos de reacción más cortos, menor consumo de
reactivos, reducción de contaminación de muestras y mejora de la sensibilidad y eficiencia
general del sistema. Además, la DMF tiene ventajas adicionales respecto a la microfluídica
convencional, entre las que se encuentran la ausencia de microcanales y bombas de propulsión
de líquidos, altas velocidades de transferencia de muestras, la rápida transferencia de calor y la
ausencia de volúmenes vacíos o “muertos” en los dispositivos. Esto se debe a que la tecnología
DMF permite controlar volúmenes discretos de muestras de forma automatizada a lo largo de
una matriz de electrodos actuadores gracias a fuerzas electroestáticas.
Con el objetivo de crear un sistema eficiente de PCR, en este trabajo se ha desarrollado una
plataforma modular de microfluídica digital que permite integrar diferentes dispositivos DMF
para la amplificación de ácidos nucleicos por PCR. Para ello, se han diseñado y fabricado por
técnicas de microfabricación diferentes dispositivos DMF con los que, tras integrarlos en la
plataforma DMF desarrollada, se han realizado diversos estudios. En primer lugar, se han
desarrollado dispositivos DMF con los que se han llevado a cabo estudios del comportamiento
dinámico del sistema microfluídico propuesto. Después, se han desarrollado dispositivos DMF
enfocados a la realización de reacciones de PCR, con calefactores resistivos integrados, con los
que se han podido llevar a cabo amplificaciones de ácidos nucleicos por PCR de forma
satisfactoria y más eficiente en comparación con los sistemas de PCR convencionales,
validando además el sistema DMF desarrollado con muestras reales. |
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| spelling | oai:dadun.unav.edu:10171-661952024-01-30T13:56:29Z Diseño, fabricación, caracterización y validación de una plataforma integrada y modular para la amplificación de secuencias específicas de ADN por PCR basada en dispositivos de microfluídica digital Zabalo-Carrere, J. (Jon) Arana-Alonso, S. (Sergio) Lorenzo, E. Microfluídica digital PCR Electrowetting Lab-on-a-chip Soja Microfabricación La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las técnicas de biología molecular más conocidas en el ámbito del diagnóstico de patologías y detección de organismos en diferentes tipos de muestras. Esta técnica permite crear múltiples copias de una secuencia específica de ADN, realizando varios ciclos compuestos por etapas a diferentes temperaturas. De esta forma, partiendo de una cantidad reducida de muestra a analizar, se crean suficientes réplicas del fragmento de ADN de interés como para que sea analizable o detectable en detalle. Entre las aplicaciones principales de la PCR destacan la detección de enfermedades infecciosas como el VIH o el SARS-CoV-2 y la detección de mutaciones en el ADN que puedan provocar enfermedades como el cáncer, además de la detección de patógenos o trazas de alérgenos en diferentes alimentos. Las reacciones de PCR se suelen llevar a cabo en equipos de laboratorio conocidos como termocicladores, los cuales están compuestos de un elemento calefactor que se encarga de ciclar térmicamente las muestras a analizar. Sin embargo, estos instrumentos requieren rampas de temperatura y volúmenes de muestra relativamente grandes para realizar las reacciones. Ante este problema, la irrupción de la tecnología lab-on-a-chip y la microfluídica han acelerado el desarrollo de sistemas miniaturizados para llevar a cabo diversos análisis de biología molecular de forma más eficiente. En concreto, la microfluídica digital (DMF) ofrece las ventajas propias de los sistemas microfluídicos convencionales como tiempos de reacción más cortos, menor consumo de reactivos, reducción de contaminación de muestras y mejora de la sensibilidad y eficiencia general del sistema. Además, la DMF tiene ventajas adicionales respecto a la microfluídica convencional, entre las que se encuentran la ausencia de microcanales y bombas de propulsión de líquidos, altas velocidades de transferencia de muestras, la rápida transferencia de calor y la ausencia de volúmenes vacíos o “muertos” en los dispositivos. Esto se debe a que la tecnología DMF permite controlar volúmenes discretos de muestras de forma automatizada a lo largo de una matriz de electrodos actuadores gracias a fuerzas electroestáticas. Con el objetivo de crear un sistema eficiente de PCR, en este trabajo se ha desarrollado una plataforma modular de microfluídica digital que permite integrar diferentes dispositivos DMF para la amplificación de ácidos nucleicos por PCR. Para ello, se han diseñado y fabricado por técnicas de microfabricación diferentes dispositivos DMF con los que, tras integrarlos en la plataforma DMF desarrollada, se han realizado diversos estudios. En primer lugar, se han desarrollado dispositivos DMF con los que se han llevado a cabo estudios del comportamiento dinámico del sistema microfluídico propuesto. Después, se han desarrollado dispositivos DMF enfocados a la realización de reacciones de PCR, con calefactores resistivos integrados, con los que se han podido llevar a cabo amplificaciones de ácidos nucleicos por PCR de forma satisfactoria y más eficiente en comparación con los sistemas de PCR convencionales, validando además el sistema DMF desarrollado con muestras reales. The Polymerase Chain Reaction (PCR) is one of the most well-known molecular biology techniques used in the diagnosis of diseases and detection of organisms in different types of samples. This technique allows for the creation of multiple copies of a specific DNA sequence by performing several cycles composed of stages at different temperatures. This way, starting from a small amount of sample to be analyzed, enough replicas of the DNA fragment of interest are created to make it analyzable or detectable in detail. Among the main applications of PCR are the detection of infectious diseases such as HIV or SARS-CoV-2, the detection of DNA mutations that may cause diseases such as cancer, and the detection of pathogens or traces of allergens in different foods. PCR reactions are usually carried out in laboratory equipment known as thermal cyclers, which are composed of a heating element that thermally cycles the samples to be analyzed. However, these instruments require temperature ramps and relatively large sample volumes to perform the reactions. In response to this problem, the emergence of lab-on-a-chip technology and microfluidics have accelerated the development of miniaturized systems to carry out various molecular biology analyses more efficiently. In particular, digital microfluidics (DMF) offers the advantages of conventional microfluidic systems such as shorter reaction times, lower reagent consumption, reduced sample contamination, and improved sensitivity and overall efficiency of the system. In addition, DMF has additional advantages over conventional microfluidics, including the absence of microchannels and liquid propulsion pumps, high transfer speeds of samples, rapid heat transfer, and the absence of void or "dead" volumes in the devices. This is because DMF technology allows for the automated control of discrete sample volumes along an array of actuator electrodes thanks to electrostatic forces. With the aim of creating an efficient PCR system, this work has developed a modular digital microfluidic platform that allows for the integration of different DMF devices for nucleic acid amplification by PCR. For this purpose, DMF devices were designed and fabricated using microfabrication techniques, and after integrating them into the developed DMF platform, various studies were carried out. Firstly, DMF devices were developed for studies of the dynamic behavior of the proposed microfluidic system. Then, DMF devices focused on performing PCR reactions, with integrated resistive heaters, were developed, which made it possible to carry out nucleic acid amplification by PCR more efficiently and satisfactorily compared to conventional PCR systems, also validating the developed DMF system with real samples. 2023-05-08T08:19:32Z 2023-05-08T08:19:32Z 2023-05 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis https://hdl.handle.net/10171/66195 spa info:eu-repo/semantics/openAccess application/pdf Servicio de Publicaciones. Universidad de Navarra |
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