Identificación y clonación de secuencias codificantes de peroxidasas de granos inmaduros de fréjol (Phaseolus vulgaris)
Las peroxidasas son hemoproteínas cuya actividad catalítica se utiliza en pruebas de diagnóstico, desarrollo de biosensores y biorremediación, las más utilizadas son la peroxidasa de rábano picante (Armoracia rusticana) o HRP y la peroxidasa de soja (Glycine max) o SBP. Actualmente estas enzimas...
| Main Author: | |
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| Other Authors: | |
| Format: | masterThesis |
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| Published: |
Universidad de Cuenca
2020
|
| Subjects: | |
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| author | Espinoza Castro, Karla Esther |
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| description | Las peroxidasas son hemoproteínas cuya actividad catalítica se utiliza en pruebas de diagnóstico,
desarrollo de biosensores y biorremediación, las más utilizadas son la peroxidasa de rábano picante
(Armoracia rusticana) o HRP y la peroxidasa de soja (Glycine max) o SBP. Actualmente estas
enzimas tienen un alto costo, por lo que es necesario buscar alternativas que permitan obtenerlas y
disponer de manera inmediata en el país para su aplicación en el desarrollo de herramientas de
diagnóstico. En la búsqueda de alternativas a las peroxidasas comerciales, se realizó una revisión de
la literatura para identificar secuencias de SBP previamente descritas, las secuencias localizadas se
utilizaron para identificar secuencias codificantes ortólogas en fréjol (Phaseolus vulgaris), con las
secuencias identificadas se diseñaron oligonucleótidos para la generación y amplificación de los
ADNc respectivos. Después de obtener el ARN total de la cutícula de granos inmaduros, se llevó a
cabo la síntesis del ADNc y la generación de productos de PCR. Los resultados de la secuenciación
de los productos de PCR mostraron que ha sido posible obtener secuencias que codifican peroxidasas
ortólogas de Ep (NP_001238315.1, NM_001251386 .1) y Prx2 (NP_001237601.1,
NM_001250672.2) a partir de fréjol. Las secuencias obtenidas en este trabajo tienen una alta identidad
con las secuencias reportadas en P. Vulgaris, Ep (PHAVU_006G129900g) con 99.08% y 99.69%
para Prx2 (PHAVU_003G078600g). Las secuencias codificantes de peroxidasas clonadas en el vector
pET15b fueron inducidas en la cepa de Escherichia coli Origami (DE3) y el extracto de proteína total
obtenido mostró actividad enzimática sobre los sustratos de peroxidasas 3,3′-diaminobencidina, 4-
cloro-1-naftol y siringaldazina. Finalmente, los resultados obtenidos permiten concluir que fue
posible obtener dos secuencias codificantes de proteínas con actividad peroxidasa a partir de
Phaseolus vulgaris. |
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| spelling | oai:dspace.ucuenca.edu.ec:123456789-351162020-12-18T18:07:23Z Identificación y clonación de secuencias codificantes de peroxidasas de granos inmaduros de fréjol (Phaseolus vulgaris) Espinoza Castro, Karla Esther Vallecillo Maza, Antonio Javier Bioquímica Sustancia bioquímica Proteínas Legumbres Enzimas Las peroxidasas son hemoproteínas cuya actividad catalítica se utiliza en pruebas de diagnóstico, desarrollo de biosensores y biorremediación, las más utilizadas son la peroxidasa de rábano picante (Armoracia rusticana) o HRP y la peroxidasa de soja (Glycine max) o SBP. Actualmente estas enzimas tienen un alto costo, por lo que es necesario buscar alternativas que permitan obtenerlas y disponer de manera inmediata en el país para su aplicación en el desarrollo de herramientas de diagnóstico. En la búsqueda de alternativas a las peroxidasas comerciales, se realizó una revisión de la literatura para identificar secuencias de SBP previamente descritas, las secuencias localizadas se utilizaron para identificar secuencias codificantes ortólogas en fréjol (Phaseolus vulgaris), con las secuencias identificadas se diseñaron oligonucleótidos para la generación y amplificación de los ADNc respectivos. Después de obtener el ARN total de la cutícula de granos inmaduros, se llevó a cabo la síntesis del ADNc y la generación de productos de PCR. Los resultados de la secuenciación de los productos de PCR mostraron que ha sido posible obtener secuencias que codifican peroxidasas ortólogas de Ep (NP_001238315.1, NM_001251386 .1) y Prx2 (NP_001237601.1, NM_001250672.2) a partir de fréjol. Las secuencias obtenidas en este trabajo tienen una alta identidad con las secuencias reportadas en P. Vulgaris, Ep (PHAVU_006G129900g) con 99.08% y 99.69% para Prx2 (PHAVU_003G078600g). Las secuencias codificantes de peroxidasas clonadas en el vector pET15b fueron inducidas en la cepa de Escherichia coli Origami (DE3) y el extracto de proteína total obtenido mostró actividad enzimática sobre los sustratos de peroxidasas 3,3′-diaminobencidina, 4- cloro-1-naftol y siringaldazina. Finalmente, los resultados obtenidos permiten concluir que fue posible obtener dos secuencias codificantes de proteínas con actividad peroxidasa a partir de Phaseolus vulgaris. Peroxidases are hemoproteins whose catalytic activity is used in diagnostic tests, development of biosensors and bioremediation, the most used are Horseradish (Armoracia rusticana) peroxidase or HRP and Soybean (Glycine max) peroxidase or SBP. Currently these enzymes have a high cost, so it is necessary to find alternatives for obtaining them and have immediate availability in the country for application in the development of diagnostic tools. In the search for alternatives to commercial peroxidase, a literature review was carried out to identify previously described sequences of SBP, the localized sequences were used to identify orthologous coding sequences in Phaseolus vulgaris (Common bean), with the identified sequences were designed oligonucleotides for the generation and amplification of the respective cDNAs. After obtaining total RNA from immature grain cuticle, synthesis of the cDNA and generation of PCR products was carried out. PCR products sequencing results showed that it has been possible to obtain sequences encoding the orthologue peroxidase of Ep (NP_001238315.1, NM_001251386 .1) and Prx2 (NP_001237601.1, NM_001250672.2) from common bean. The sequences obtained in this work have a high identity with the reported sequences in Ph. vulgaris, Ep (PHAVU_006G129900g) with 99.08 % and 99.69 % for Prx2 (PHAVU_003G078600g). Cloned coding peroxidases sequences in pET15b vector were induced Escherichia coli Origami (DE3) and total protein extract obtained showed enzymatic activity on 3,3′- diaminobenzidine, 4-chloro-1-naphthol and syringaldazine peroxidases substrates. Finally, the results obtained allow us to conclude that it was possible to obtain two protein coding sequences with peroxidase activity from Phaseolus vulgaris. Magíster en Biociencias Aplicadas Cuenca 2020-12-09T20:53:27Z 2020-12-09T20:53:27Z 2020-12-09 masterThesis http://dspace.ucuenca.edu.ec/handle/123456789/35116 spa TM4;1775 Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ openAccess application/pdf application/pdf Universidad de Cuenca |
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