| Summary: | La sortasa A (SrtA) es una proteína con actividad endopeptidasa y transpeptidasa de bacterias
Gram negativas, Gram positivas y arqueas utilizada como herramienta para diferentes aplicaciones
biotecnológicas entre ellas la producción y purificación de proteínas recombinantes. El sistema de
purificación basado en la actividad enzimática de SrtA optimiza el procesamiento de proteínas por
lo tanto su utilización facilita la clarificación de proteínas de diferente naturaleza para alcanzar
pureza considerable.
Objetivo:
El objetivo del presente trabajo fue generar un sistema de producción y purificación de proteínas
recombinantes basado en la Sortasa A de Staphylococcus aureus (Sa-SrtA).
Procedimiento:
El sistema de purificación basado en la Sa-SrtA, se realizó a través de modificaciones sucesivas
al vector pE15b NT-Histidina (H/His) (Novagen), desde la adición del segmento codificante
(GenBank Ac.No.: AF162687) Δ60Sa-SrtA de S. aureus (ATCC12598), posteriormente se colocó
la secuencia codificante del motivo consenso LPET4G, el sitio de reconocimiento de la Sa-SrtA,
en donde se realizar el corte proteolítico para la separación de la proteína de interés. Para evaluar
la funcionalidad del sistema, se movilizó el sitio de corte NdeI clonado en los sitios de restricción
NdeI/BamHI. Río abajo del péptido LPET4G, se introdujo las secuencias codificantes de las
proteínas antigénicas NcGRA7 (GenBank Ac.No.: U82229) y NcSAG4 (GenBank Ac.No.:
AY763105) de Neospora caninum. Estos elementos permitieron la generación de construcciones
genéticas para las proteínas de fusión: His-tag-Δ60Sa-SrtA-LPET4G-NcGRA7 y -tag-Δ60Sa-
SrtA-LPET4G-NcSAG4. Las construcciones fueron introducidas en la cepa de Escherichia coli
Rosetta 2 (DE3) para la expresión de las proteínas. Las proteínas de fusión se purificaron mediante
Cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC). En el proceso cromatográfico, las
proteínas de fusión fueron capturadas en la resina de Ácido nitrilotriacético-níquel (Ni-NTA) y
tras la adición de Ca2 + y Gli3
, la proteína de fusión inmovilizada sufre una escisión mediada por Δ60Sa-SrtA en la columna para liberar selectivamente las proteínas diana.
Resultados:
Se obtuvo un modelo bacteriano para la generación proteínas recombinantes purificadas mediante
la actividad enzimática de la Δ60Sa-SrtA. El sistema permitió la purificación de la proteína
recombinante de N. caninum 4G-NcGRA7 que podría ser utilizadas para la generación de sistema
de diagnóstico. La expresión de la proteína 4G-NcSAG4 no se obtuvo por cuanto la proteína
resultó insoluble en el sistema de expresión.
Conclusiones:
El sistema de purificación basado en Δ60Sa-SrtA es útil para el procesamiento de proteínas
recombinantes.
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