Estandarización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica para la amplificación del fragmento rs35532010 presente en el gen de la beta globina
Las talasemias son enfermedades hereditarias que resultan de defectos genéticos que causan una alteración en la síntesis de las cadenas de globina. La β-talasemia engloba un conjunto de mutaciones que provocan defectos en las cadenas β-globina. La mutación 27/28 +C, se caracteriza por la inserció...
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Universidad de Cuenca
2023
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causan una alteración en la síntesis de las cadenas de globina. La β-talasemia engloba un
conjunto de mutaciones que provocan defectos en las cadenas β-globina. La mutación 27/28
+C, se caracteriza por la inserción de un nucleótido de citosina que provoca un cambio en el
marco de lectura del gen dando lugar a la β-talasemia. Aunque se han reportado pocos casos
en países donde la prevalencia de β-talasemia es muy alta, la información sobre esta
mutación en Latinoamérica resulta escasa. Sin embargo, datos no publicados han identificado
esta mutación de forma prevalente en la población ecuatoriana. El presente trabajo de
titulación tuvo como objetivo principal estandarizar un protocolo PCR para la amplificación del
polimorfismo rs35532010 del gen de la hemoglobina subunidad beta (HBB). Se emplearon
muestras de ADN comercial y cebadores específicos para amplificar el fragmento del gen en
donde se ubica dicha mutación. Se realizaron tres distintos protocolos para la
estandarización, siendo el primer ensayo el que permitió establecer las condiciones ideales
de 1μl de ADN diluido a 80ng/μl, a una temperatura de alineación 64oC, para la identificación
del fragmento mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Sin embargo, se recomienda
el uso de gel de poliacrilamida, de mayor resolución y amplio rango de separación, para
mejorar la visualización de las bandas. La estandarización de este protocolo será de gran
utilidad para una posterior secuenciación y así determinar el estado de cigosidad alélica en
pacientes con β-talasemia. |
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| spelling | oai:dspace.ucuenca.edu.ec:123456789-433802023-11-08T16:06:28Z Estandarización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica para la amplificación del fragmento rs35532010 presente en el gen de la beta globina Rodriguez Bravo, Axel Joffrey Valle Soledispa, Miguel Alexander Neira Molina, Vivian Alejandra Bioquímica Enfermedades hereditarias Estandarización Mutación CIUC::Química::Bioquímica::Genética Bioquímica Las talasemias son enfermedades hereditarias que resultan de defectos genéticos que causan una alteración en la síntesis de las cadenas de globina. La β-talasemia engloba un conjunto de mutaciones que provocan defectos en las cadenas β-globina. La mutación 27/28 +C, se caracteriza por la inserción de un nucleótido de citosina que provoca un cambio en el marco de lectura del gen dando lugar a la β-talasemia. Aunque se han reportado pocos casos en países donde la prevalencia de β-talasemia es muy alta, la información sobre esta mutación en Latinoamérica resulta escasa. Sin embargo, datos no publicados han identificado esta mutación de forma prevalente en la población ecuatoriana. El presente trabajo de titulación tuvo como objetivo principal estandarizar un protocolo PCR para la amplificación del polimorfismo rs35532010 del gen de la hemoglobina subunidad beta (HBB). Se emplearon muestras de ADN comercial y cebadores específicos para amplificar el fragmento del gen en donde se ubica dicha mutación. Se realizaron tres distintos protocolos para la estandarización, siendo el primer ensayo el que permitió establecer las condiciones ideales de 1μl de ADN diluido a 80ng/μl, a una temperatura de alineación 64oC, para la identificación del fragmento mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Sin embargo, se recomienda el uso de gel de poliacrilamida, de mayor resolución y amplio rango de separación, para mejorar la visualización de las bandas. La estandarización de este protocolo será de gran utilidad para una posterior secuenciación y así determinar el estado de cigosidad alélica en pacientes con β-talasemia. Thalassemias are hereditary diseases resulting from genetic defects that cause an alteration in the synthesis of globin chains. The β-thalassemia encompasses a group of mutations that cause defects in the β-globin chains. The 27/28 +C mutation, is characterized by the insertion of a cytosine nucleotide that causes a change in the reading frame of the gene resulting in β- thalassemia. Although few cases have been reported in countries where the prevalence of β- thalassemia is very high, information on this mutation in Latin America is scarce. However, unpublished data have identified this mutation as prevalent in the Ecuadorian population. The main objective of this titration work was to standardize a PCR protocol for the amplification of the rs35532010 polymorphism of the hemoglobin beta subunit (HBB) gene. Commercial DNA samples and specific primers were used to amplify the fragment of the gene where this mutation is located. Three different protocols were performed for standardization, being the first assay the one that allowed establishing the ideal conditions of 1μl of DNA diluted at 80ng/μl, at an alignment temperature of 64oC, for fragment identification by electrophoresis in 2% agarose gel. However, the use of polyacrylamide gel, of higher resolution and wide separation range, is recommended to improve the visualization of the bands. Standardization of this protocol will be of great utility for subsequent sequencing to determine allelic zygosity status in patients with β-thalassemia. 0000-0002-1615-0746 2023-11-07T18:54:24Z 2023-11-07T18:54:24Z 2023-11-07 http://dspace.ucuenca.edu.ec/handle/123456789/43380 spa TBQ;885 Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ openAccess application/pdf 70 páginas application/pdf Universidad de Cuenca |
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